我的科研之路：在探索中成长

杜张萌

华中农业大学刘主实验室 

各位老师好！我是华中农业大学生命科学技术学院刘主老师实验室的博士研究生杜张萌。非常感谢贺老师的邀请，让我能在这里分享我这几年在科研道路上的学习、探索与成长。

我是湖北荆门人。2021年，带着对华中农业大学的向往，我从四川农业大学回到家乡，加入了刘主老师实验室，开始研究生阶段的学习。

本科阶段的茶学学习让我进入了农业科学的大门。但在学习过程中我逐渐发现，很多关键问题最终都需要回到分子机制层面才能得到深入解释。基于这样的认识，我在研究生阶段选择转向生物化学与分子生物学，希望通过更系统的科研训练，使自己在未来无论是继续从事科研，还是服务于农业相关领域，都具备更强的适应性和发展潜力。

跨专业意味着我必须从头学习生物化学与分子生物学的核心内容。刚进实验室的那段时间，我每天从最基础的实验操作学起：怎么配缓冲液、怎么做亲和纯化、怎么判断蛋白性质是否良好、怎么做荧光标记等。白天跟着师姐学习，晚上把当天的知识整理成word文档，一遍遍回顾，生怕漏掉任何一个细节。

除了实验操作，我也在迅速补充理论。从膜蛋白的结构特性，到转运体的工作原理，再到smFRET的原理及应用，我都一边读文献、一边做笔记。每月一次的文献分享和文献调研，是我成长最快的阶段。每次汇报之后，刘老师都会对文献的逻辑、亮点概括等方面提出精准的建议，这些能力后来在我自己开展课题、设计实验时发挥了极大作用。

逐渐清晰的科研方向：揭示植物如何吸收稀缺的磷

经过两年的积累，我对实验室研究的核心方向——植物磷稳态调控有了更深入的理解。对于植物来说，磷是植物生长发育所必不可少的一种大量营养元素。但是在土壤中，磷酸根易与阳离子形成阳离子磷酸盐沉积物，植物可利用的磷酸盐浓度仅为10 μM左右。如此低浓度的磷酸盐使得磷素缺乏成为农业生产中的常见问题。提高植物的磷吸收效率，不仅是基础科学问题，也是绿色农业的重要方向。

在前人研究中，PHT1家族蛋白被证明是植物根系中负责吸收磷酸盐的主要转运体。尤其在低磷条件下，转录因子PHR2会显著上调PHT1家族成员的表达，使植物提高对磷的吸收能力。然而，这些转运体为什么会表现出高、低亲和力差异？它们内部的构象转变是什么样的？这些关键问题仍未完全解决。

基于此，我的研究围绕两个科学问题展开：1、PHT1蛋白如何识别并转运磷酸根？2、在转运过程中，蛋白的构象动态是如何变化的？

这两个问题的解答将帮助我们深入理解磷转运的分子机制，更可能为培育磷高效作物提供理论基础。

从失败中前进：PT11活性检测的反复探索

我们选择水稻PHT1家族中的PT11作为研究对象。我首先进行了PT11的重组表达，并将其重构至人工脂质体中，构建一个只有蛋白+磷脂的纯净体系，以便研究其本征转运能力。

然而，实际实验远比预想复杂。我们尝试了孔雀石绿法、ACMA法等跨膜转运检测手段，但无论如何优化体系，始终无法得到可信的阳性结果。那段时间几乎每天都在重复实验、调整条件、重新配反应体系，甚至一度以为自己表达的蛋白根本不具备转运活性。

最终，我们决定采用更灵敏、但操作有一定危险系数的同位素³²P检测方法。在陈艳可老师的指导下，我逐渐克服了对放射性同位素的恐惧，从最基础的安全操作，到实验背景扣除与转运活性校正，一点点摸索。经过几个月的不断优化，我们终于首次检测到PT11的³²P转运信号，明确证明了PT11是一个低亲和力转运体。

那一刻的欣喜，至今仍是我科研经历里最难忘的瞬间之一。

从静态结构到动态机制：PT11的构象变化

在功能验证之后，我们成功解析了PT11的高分辨率冷冻电镜结构。结构显示，PT11采用典型的MFS-fold折叠方式，我们确定了磷酸根结合口袋的多个关键氨基酸。此外，我们还发现三个保守的酸性残基（D39、D42、D150）聚集在通道附近，可能承担质子耦联的关键作用。

然而，静态结构往往只能提供蛋白构象的“瞬间定格”，难以反映其在转运过程中的连续动态变化。为此，我们尝试引入包括质谱在内的多种方法，期望从不同层面捕捉转运体的构象变化。然而，在膜蛋白体系中，质谱分析面临着去垢剂与脂质环境干扰、构象异质性高等挑战，使得动态信息的解析受到一定限制。综合方法学可行性等方面，我们最终将研究重心转向单分子荧光共振能量转移（smFRET），以期直接可视化转运体在工作状态下的实时构象动态。

smFRET是一种能够实时监测蛋白构象变化的强大技术。它依赖两个荧光团之间的距离变化，通过FRET信号的改变反映蛋白的形变过程。但PT11是二聚体，这意味着如果两个荧光团分别位于不同单体上，会产生分子间FRET干扰。

为了解决这个问题，我们建立了异源二聚体系统：让一个单体携带生物素标签用于固定；另一个单体携带荧光标记位点。两种单体共表达后，三种组合的二聚体会自然形成，但在固定过程中，具有分子间FRET的二聚体会因无法被固定在玻片上而被洗掉，保留下来的都是可测量分子内构象变化的“干净样本”。

这套体系的建立，为后续动态研究奠定了非常坚实的基础。

亲和力差异背后的动态密码

PHT1家族成员众多，在水稻中就有13个，这些转运体序列和结构非常相似，却有着不同的磷酸根转运能力，可以分为高、低亲和力转运体。我们猜测这是否因为这些转运体之间存在一些动态性质上的差异。

smFRET的结果让我们非常惊喜。与低亲和力转运体PT11相比，高亲和力转运体PT8更倾向于处于胞外开放构象，这一构象特征可能有利于其在低外源磷酸盐浓度条件下更高效地捕获底物。与此一致，体外转运活性实验表明，我们重组表达的PT8蛋白的转运活性明显高于PT11。这些结果逐渐将线索串联起来，提示高、低亲和力转运体在效率上的差异，或许并不源于静态结构的不同，而是隐藏在其构象动态的偏好之中。

进一步的突变实验验证了这一模型：打破胞外侧gate的R55A使外侧开放比例增加，转运活性显著增强；打破胞内侧gate的F429A则使其构象分布向胞内开放偏移，活性下降。

这些结果从动态层面揭示了高、低亲和力的根本差异，为理解PHT1家族的功能提供了新视角。

科研意义与未来方向

在获得所有数据后，我们将文章投稿至Cell，稍有遗憾的是，编辑建议转投了Developmental Cell，经历审稿、补实验、再修改，最终顺利接收。那一刻，我感受到自己与团队一起推动科学向前迈出一点点时的力量。

下一步，我们希望将这些能够提高PT11活性的关键突变与水稻育种实践结合，正在尝试培育高效利用磷素的水稻材料，为减少化肥使用、推动农业绿色发展贡献力量。

回望走过的历程，我深深感受到科研不仅是解答问题的过程，更是认识自我、锤炼自我的过程。从最初的跨专业焦虑，到实验失败后的无数次重来，再到拿到关键数据时的激动，每一步都让我变得更加稳重、更加勇敢，也更加热爱这条道路。

我由衷地感谢导师刘主教授的悉心指导，感谢课题组所有老师与同学的支持，感谢国家与学校提供的平台。我很庆幸自己能够参与这样一项有意义的研究。

科研的道路漫长且充满未知，但正是这些困难、疑问与突破，构成了生命科学的魅力，也让我在探索世界的同时，看见了一个更坚韧、更广阔的自己。

未来，我会继续带着这份热忱，努力前行。 

照片拍摄于2025年9月29日，作物遗传改良全国重点实验室A110
杜张萌（左），刘主老师（右）

Cryo-EM structure and dynamic basis of phosphate uptake by PHT1 in rice,  Developmental Cell, 2025, DOI: 10.1016/j.devcel.2025.09.003 (https://doi.org/10.1016/j.devcel.2025.09.003)

2025-12-13于武汉

杜张萌，duzhangmeng@webmail.hzau.edu.cn